CXCL6 Merekayasa Progresi Karsinoma Kolangioselular dan Resistensi Imunoterapi Melalui Modulasi Metabolisme Lipid dan Induksi NETs
Abstrak
Kemokin CXCL6 diidentifikasi sebagai regulator penting proses biologis pada berbagai keganasan. Namun, fungsinya dalam karsinoma kolangioselular (CCA) masih kurang dieksplorasi. Profiling tumor untuk CXCL6 dilakukan menggunakan database publik. Eksperimen in vitro dan in vivo digunakan untuk mengevaluasi efek onkogenik CXCL6 pada CCA. Selain itu, RNA-Seq digunakan untuk mendeteksi perubahan transkriptomik terkait ekspresi CXCL6 pada sel CCA dan neutrofil. Molecular docking, kolokalisasi fluoresensi, dan Co-IP digunakan untuk menjelaskan interaksi langsung antara JAK dan CXCR1/2. Selanjutnya, lipidomik LC-MS dan dampak CXCL6 pada imunoterapi dieksplorasi secara in vivo.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa CXCL6 mengalami peningkatan regulasi pada jaringan CCA dan mempromosikan proliferasi serta metastasis CCA. Secara mekanistik, CXCL6 meregulasi aksis CXCR1/2-JAK-STAT/PI3K pada CCA melalui pensinyalan autokrin, yang mengarah pada pemrograman ulang metabolisme lipid, dan mempromosikan pembentukan perangkap ekstraseluler neutrofil (NETs) dengan mengaktifkan jalur RAS/MAPK pada neutrofil. Pada akhirnya, pembentukan NETs menginduksi resistensi imunoterapi pada CCA dengan menghalangi infiltrasi sel T CD8+. CXCL6 memodulasi progresi CCA melalui aksis CXCR1/2-JAK-STAT/PI3K dan membentuk ulang metabolisme lipidnya. CXCL6 juga memediasi resistensi imunoterapi melalui NETs, yang mungkin menjadi target terapeutik dan biomarker potensial untuk CCA.
Pendahuluan
Insidensi karsinoma kolangioselular (CCA) secara global terus meningkat, terutama di Asia. CCA berasal dari sel epitel saluran empedu dan biasanya dibagi lagi menjadi kolangiokarsinoma intrahepatik (iCCA), kolangiokarsinoma periportal (pCCA), dan kolangiokarsinoma distal (dCCA). Karena onsetnya yang tersembunyi, sebagian besar pasien didiagnosis pada stadium lanjut, dengan hanya 15–30% yang memenuhi syarat untuk operasi dan tingkat kekambuhan melebihi 50%.
Mengingat hal ini, terapi obat sistemik telah menjadi andalan untuk CCA stadium lanjut. Kemoterapi berbasis gemcitabine (GEM) secara tradisional merupakan pengobatan yang paling umum. Meskipun demikian, kemajuan dalam teknologi sekuensing memungkinkan analisis sistematis gen-gen yang bermutasi terkait CCA, menginspirasi gelombang pengobatan bertarget. Obat-obatan yang menargetkan FGFR2, IDH1/2, HER2, dan IDH2 telah banyak dilaporkan dan bahkan digunakan secara klinis pada CCA. Sementara itu, kombinasi kemoterapi dengan imunoterapi membuka era baru, sehingga kombinasi GEM plus cisplatin (GC) dengan imunoterapi kini menjadi pengobatan lini pertama untuk CCA. Namun, hasil terbaru dari uji klinis TOPAZ-1 menunjukkan tingkat respons keseluruhan hanya 26,7% dengan GC plus antibodi anti-PD-L1 durvalumab, yang masih jauh dari memuaskan. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk memahami mikro lingkungan imun tumor (TIME) CCA dan mengidentifikasi strategi yang sesuai untuk mengatasi resistensi imun.
TIME CCA adalah sistem yang sangat kompleks dan dinamis yang terdiri dari sel tumor, komponen imun, dan pembuluh darah, di antara konstituen lainnya. Komponen-komponen yang berbeda ini berinteraksi satu sama lain dengan cara yang sangat memengaruhi kejadian, perkembangan, dan resistensi imun CCA, yang dicirikan sebagai "tumor dingin" dengan stroma desmoplastik padat yang dapat mengeluarkan molekul pendorong angiogenesis seperti faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF). Dengan demikian, menargetkan angiogenesis adalah pilihan anti-CCA yang potensial dan titik awal penelitian kami.
Sel imun juga dianggap penting secara fungsional dalam memediasi resistensi imunoterapi CCA. Selain sel T CD8+ yang telah banyak dipelajari, sel imun bawaan seperti neutrofil terkait tumor (TANs) juga telah terbukti sangat terkait dengan perkembangan tumor dan kelangsungan hidup keseluruhan (OS) pasien. Jumlah TANs telah dikaitkan dengan prognosis pasien operasi CCA, tetapi mekanisme fungsionalnya belum sepenuhnya dianalisis. Namun, penelitian terbaru mengungkapkan bahwa TANs dapat membentuk NETs di ruang ekstraseluler dan sangat membentuk ulang TIME, menunjukkan cara penting di mana TANs dapat menginduksi resistensi imunoterapi pada CCA.
Selanjutnya, kemokin dapat berfungsi sebagai jembatan antara CCA dan neutrofil. Subfamili kemokin motif C-X-C (CXCL) adalah kelas kemokin penting dengan hubungan erat dengan proses biologis tumor; CXCL bertindak sebagai faktor kemotaktik untuk TANs, memediasi rekrutmen mereka ke dalam TIME untuk mempromosikan resistensi obat tumor. Kemokin ini juga secara langsung mengatur proses dalam sel kanker. Misalnya, CXCL1, CXCL2, dan CXCL8 dilaporkan memengaruhi proliferasi sel kanker paru-paru dan juga memengaruhi angiogenesis, yang dapat menyebabkan infiltrasi neutrofil dan makrofag ke dalam tumor dan menginduksi resistensi anlotinib.
Dengan mengikat reseptor kemokin motif C-X-C (CXCR), CXCL mengaktifkan beberapa jalur terkait tumor termasuk MAPK, STAT, TGF-β, dan β-catenin, sehingga memodulasi perkembangan dan metabolisme sel tumor, mengisyaratkan kemungkinan hubungan mekanistik antara pensinyalan kemokin dan resistensi pengobatan CCA. Khususnya, ekspresi berlebihan CXCL6 dilaporkan pada sel CCA ganas dengan stemness tinggi; juga ditemukan untuk mempromosikan progresi tumor pada karsinoma hepatoseluler (HCC) dan kanker paru-paru non-sel kecil, dan untuk mengatur infiltrasi neutrofil pada kanker lambung. Namun, fungsi dan mekanisme CXCL6 pada CCA belum diselidiki secara rinci.
Dalam penelitian ini, kami bertujuan untuk mengeksplorasi fungsi dan mekanisme CXCL6 pada sel CCA dan TIME. Kami menunjukkan bahwa ekspresi CXCL6 meregulasi proliferasi, metastasis, dan prognosis pada CCA melalui modulasi aksis CXCR1/2-JAK-STAT/PI3K. Pada akhirnya, CXCL6 dapat membentuk ulang metabolisme lipid pada sel CCA, dan ekspresi berlebihnya juga terkait dengan resistensi imunoterapi CCA karena CXCL6 menginduksi pembentukan NETs dan menyebabkan penurunan infiltrasi sel T CD8+. Secara keseluruhan, hasil kami menempatkan CXCL6 sebagai regulator penting dalam perkembangan CCA dan resistensi imunoterapi dengan membentuk ulang metabolisme lipid dan menginduksi pembentukan NETs.
Hasil
CXCL6 Mengalami Peningkatan Regulasi pada Jaringan Tumor CCA dan Berkorelasi dengan Prognosis Buruk serta Peningkatan Keganasan
Pos pemeriksaan terkait angiogenesis dianggap sebagai pendorong utama progresi dan perkembangan CCA. Oleh karena itu, selain mengandung vaskularisasi, agen anti-angiogenik dapat membentuk ulang TIME dan meningkatkan efikasi kemoterapi dan imunoterapi. Untuk mengidentifikasi gen-gen kunci yang berkontribusi pada angiogenesis dan progresi pada CCA, kami menjelajahi database The Cancer Genome Atlas (TCGA) (TCGA-CHOL) untuk mencari persimpangan gen yang sangat diekspresikan pada CCA (log2|FC| ≥ 1, P ≤ 0,05), terkait prognosis (HR > 1, P ≤ 0,1), dan terkait dengan angiogenesis (yaitu, gen yang termasuk dalam dataset "HALLMARK_ANGIOGENESIS" dari Molecular Signatures Database). CXCL6 adalah satu-satunya gen yang memenuhi semua kriteria dan selanjutnya divalidasi sebagai penanda prognostik untuk DSS pada CCA.
Analisis pan-kanker berdasarkan data TCGA mengungkapkan peningkatan ekspresi CXCL6 di berbagai keganasan, terutama pada CCA (P ≤ 0,01). Kami menguatkan temuan ini dengan membandingkan 10 spesimen jaringan reseksi bedah berpasangan dari pasien CCA di Rumah Sakit Zhongshan. Hasil Western blot dan RT-qPCR menunjukkan peningkatan kadar CXCL6 pada jaringan tumor dibandingkan jaringan non-tumor berpasangan. Ekspresi tumor diferensial selanjutnya dikonfirmasi oleh pewarnaan IHC dari microarray jaringan (TMA) "Surgery cohort" dari Rumah Sakit Zhongshan, memungkinkan kami untuk mencapai kesimpulan yang sama bahwa CXCL6 diekspresikan berlebihan pada jaringan tumor (P < 0,001). Menggunakan TMA yang sama untuk menganalisis signifikansi klinis CXCL6 mengungkapkan bahwa pasien dengan ekspresi yang lebih tinggi memiliki OS yang secara signifikan lebih buruk (P = 0,028) dan EFS (P = 0,046).
Untuk mengeksplorasi efeknya pada tumorigenesis pada tingkat seluler, kami pertama kali mengukur kadar protein CXCL6 pada panel lima lini sel CCA umum. Sel HuCCT1 dan RBE menunjukkan ekspresi CXCL6 tertinggi, sedangkan CCLP1 menunjukkan yang terendah. Dengan demikian, kami memilih untuk menekan CXCL6 pada lini sel HuCCT1 dan RBE dan mengekspresikan berlebihan pada sel CCLP1. Kami membuat lini sel sh-CXCL6 (penekanan CXCL6 melalui tiga shRNA penargetan dan satu kontrol nontargeting [NC]) dan CXCL6-OE (ekspresi berlebihan CXCL6 melalui plasmid) dan mengkonfirmasi efisiensi transfeksi lentivirus dan plasmid dengan western blot. Analisis western blot dari lini sel penekanan dan ekspresi berlebihan mengungkapkan bahwa CXCL6 terkait dengan metastasis (E-cadherin dan N-cadherin), invasi (vimentin), dan proliferasi (PCNA) pada CCA.
CXCL6 Mendorong Perkembangan CCA dan Mensensitisasi Efek Gemcitabine Baik In Vitro Maupun In Vivo
Kami selanjutnya melakukan uji fungsional in vitro untuk mengevaluasi peran CXCL6 dalam proliferasi seluler dan perkembangan CCA. Penekanan CXCL6 mengganggu pertumbuhan klonogenik sel HuCCT1 (P < 0,001) dan RBE (P < 0,001), sementara ekspresi berlebihan CXCL6 meningkatkan pembentukan koloni sel CCLP1 (P < 0,001). Eksperimen proliferasi sel CCK-8 menunjukkan tren yang sama, seperti halnya uji inkorporasi EdU untuk memverifikasi dampak penekanan atau ekspresi berlebihan CXCL6 pada proliferasi seluler. Uji penyembuhan luka dan transwell dengan lini sh-CXCL6 dan CXCL6-OE secara bersama-sama menunjukkan bahwa CXCL6 memiliki efek positif pada migrasi sel CCA. Untuk menyelidiki kaitannya dengan angiogenesis, kami mengumpulkan media terkondisi dari kultur sel CCA dan menggunakannya untuk mengkultur HUVEC dalam uji pembentukan tabung. ELISA mengkonfirmasi penurunan kadar CXCL6 dalam supernatan sh-CXCL6 dan peningkatan kadar dalam supernatan CXCL6-OE. Ketika dikultur dengan media terkondisi sh-CXCL6, kapasitas pembentukan tabung HUVEC secara signifikan dilemahkan, sedangkan ditingkatkan dengan adanya media terkondisi CXCL6-OE.
Kami kemudian melakukan analisis in vivo pada tikus telanjang BALB/c untuk menilai fungsi CXCL6, menggunakan sel HuCCT1 sh-NC atau sh-CXCL6 untuk fokus secara khusus pada dampaknya pada sel tumor. Hasil menunjukkan bahwa penipisan CXCL6 secara signifikan mengurangi berat tumor (P < 0,001) dan volume (P = 0,001). Pewarnaan H&E dan IHC mengkonfirmasi penurunan keganasan (Ki-67) dan angiogenesis (CD31, VEGF) pada tumor sh-CXCL6. Hasil di atas secara bersama-sama menggambarkan bahwa CXCL6 dapat secara signifikan memengaruhi keganasan, proliferasi, dan angiogenesis pada tumor CCA.
Karena kemoterapi berbasis GEM masih merupakan pilihan lini pertama pada CCA yang tidak dapat direseksi, kami selanjutnya bertanya apakah CXCL6 dapat memodulasi efikasi terapeutiknya. In vitro, penekanan CXCL6 bersinergi dengan GEM untuk menekan proliferasi dan migrasi sel CCA. Mengobati lini sel CCA dengan 200 nm GEM menunjukkan (melalui uji γ-H2AX) bahwa penekanan CXCL6 memperparah kerusakan DNA yang diinduksi obat pada sel HuCCT1 dan RBE. Efek sensitisasi penekanan CXCL6 ini dikonfirmasi secara in vivo dengan membangun model xenograft tikus. Seperti sebelumnya, sel HuCCT1 sh-NC dan sh-CXCL6 disuntikkan secara subkutan pada tikus telanjang BALB/c. Sementara pengobatan GEM jelas mengurangi berat tumor dan volume tumor, penekanan CXCL6 lebih lanjut meningkatkan efikasinya. Secara keseluruhan, hasil-hasil sebelumnya menggambarkan bahwa penekanan CXCL6 dapat mengatasi resistensi GEM pada CCA.
CXCL6 Mengatur Proliferasi dan Migrasi CCA Melalui Jalur JAK-STAT/PI3K-AKT
Untuk mengeksplorasi mekanisme potensial yang mendasari regulasi proliferasi dan migrasi yang dimediasi CXCL6 pada CCA, RNA-Seq dilakukan pada sel HuCCT1 sh-NC dan sh-CXCL6, mengidentifikasi 233 gen yang secara signifikan diatur naik dan 171 gen yang diatur turun (dengan q-value ≤ 0,05 dan log|FC| ≥ 1). Penerapan analisis jalur KEGG mengidentifikasi lima jalur yang secara signifikan diperkaya, di antaranya jalur PI3K-AKT dan JAK-STAT paling signifikan diperkaya pada sel sh-CXCL6 versus sel sh-NC. GSEA juga menyoroti pengayaan signifikan dari "jalur pensinyalan PI3K-AKT" dan "jalur pensinyalan JAK-STAT". Jalur JAK-STAT, diaktifkan oleh sitokin, telah terlibat dalam karsinogenesis dan perkembangan pada berbagai tumor dan juga mampu mengatur proliferasi dan fungsi sel saluran empedu. Demikian pula, PI3K-AKT adalah jalur transduksi sinyal menonjol yang diaktifkan pada tumor padat dan hematologi. Pada CCA, jalur ini diketahui memainkan peran sentral dalam proliferasi, regulasi siklus sel, dan metabolisme. Oleh karena itu, kami berasumsi bahwa CXCL6 dapat memberikan efeknya pada CCA melalui pensinyalan JAK-STAT dan PI3K-AKT.
Untuk memvalidasi hasil pengayaan jalur, kami menerapkan western blot dengan sel HuCCT1 dan RBE sh-CXCL6 dan sel CCLP1 CXCL6-OE untuk mendeteksi faktor-faktor penting di kedua jalur, mengamati penurunan aktivasi dengan penekanan CXCL6 dan peningkatan aktivitas jalur setelah ekspresi berlebihan CXCL6. Untuk mencari konfirmasi lebih lanjut, sel diobati dengan inhibitor JAK1/2 ruxolitinib atau inhibitor PI3K 3-methyladenine (3-MA). Sementara ekspresi berlebihan CXCL6 meningkatkan migrasi in vitro dan proliferasi pada sel-sel ini, kedua efek tersebut dilemahkan oleh penambahan ruxolitinib atau 3-MA. Data ini mendukung keterlibatan jalur JAK-STAT dan PI3K-AKT dalam fungsi onkogenik CXCL6.
CXCL6 Mengaktifkan Aksis CXCR1/2-JAK-STAT/PI3K pada CCA
Kami selanjutnya menjelaskan bagaimana CXCL6 meregulasi pensinyalan JAK-STAT dan PI3K-AKT pada CCA dengan mempertimbangkan bahwa CXCL6, sebagai kemokin sekretori, harus mengikat reseptor permukaan membrannya CXCR1/2 untuk mengatur fungsi seluler. Ekspresi kedua reseptor telah dilaporkan pada neutrofil, sel endotel, dan sel tumor, di mana mereka terlibat dalam rekrutmen neutrofil, penyakit inflamasi, dan progresi tumor. Protein keluarga JAK dapat mengikat dan mengaktifkan reseptor sitokin dengan memfosforilasi reseptor tersebut setelah pengikatan ligan, yang mengarah pada pembentukan kompleks reseptor sitokin Janus kinase dimerik yang selanjutnya dapat merekrut dan memfosforilasi protein seperti STAT atau PI3K. Berdasarkan hal ini, kami berhipotesis bahwa pada sel CCA, CXCL6 mungkin memberikan efek yang diamati melalui aksis CXCR1/2-JAK-STAT/PI3K. Meskipun pengikatan JAK ke CXCR1/2 belum pernah terbukti sebelumnya, kami melakukan eksperimen berikut untuk menguji hipotesis kami.
Pewarnaan imunofluoresensi pada jaringan CCA yang tertanam parafin mengungkapkan kolokalisasi spasial yang kuat dari JAK1/CXCR1 dan JAK1/CXCR2. Uji Co-IP dengan JAK1 sebagai umpan mengungkapkan interaksi dengan CXCR1 dan CXCR2 pada sel HuCCT1 dan RBE. Co-IP timbal balik dengan CXCR1/2 sebagai umpan lebih lanjut memvalidasi interaksi ini. Kami juga menerapkan molecular docking untuk mengevaluasi kemungkinan pengikatan antara JAK1 dan reseptor CXCL6. Menggunakan GRAMM, kami melakukan docking semifleksibel antara JAK1/CXCR1 dan JAK1/CXCR2; hasilnya menunjukkan pengikatan JAK1 yang stabil dan terprediksi ke kedua reseptor. Energi pengikatan JAK1/CXCR1 yang dihitung adalah −35,1 kcal mol−1 dan area antarmuka adalah 3523 A˚2, sedangkan nilai ekuivalen untuk JAK1/CXCR2 adalah −8,1 kcal mol−1 dan 3130,9 A˚2. Secara keseluruhan, hasil di atas menunjukkan pengikatan JAK1 ke kedua reseptor CXCL6. Untuk memvalidasi secara fungsional keterlibatan reseptor, kami menggunakan reparixin dan SB225002 sebagai antagonis selektif untuk CXCR1 dan CXCR2, masing-masing. Pengobatan dengan salah satu inhibitor mengganggu fosforilasi JAK. Pada sel CCLP1 CXCL6-OE, reparixin dan SB225002 mampu menghambat keganasan, proliferasi, dan migrasi.
Karena dilaporkan bahwa jalur JAK-STAT dan PI3K-AKT keduanya mengaktifkan ekspresi HIF-1α, kami menerapkan pewarnaan IHC pada tumor tikus telanjang dan menemukan bahwa ekspresi HIF-1α lebih rendah pada sel sh-CXCL6. Kesimpulannya, aksis CXCR1/2-JAK-STAT/PI3K adalah mekanisme potensial di mana CXCL6 memainkan perannya pada CCA.
CXCL6 Membentuk Ulang Metabolisme Lipid CCA
Jalur JAK-STAT dan PI3K-AKT mengatur proses biologis pada sel tumor dengan berbagai cara. Khususnya, jalur JAK-STAT terbukti meningkatkan sintesis asam lemak de novo dan penyerapan asam lemak di TIME, sementara aktivasi PI3K-AKT dapat menyebabkan peroksidasi lipid pada kanker lambung. Untuk mengeksplorasi kemungkinan ini pada CCA, kami menerapkan analisis GO-BP (Gene Ontology – Biological Processes) pada data RNA-Seq yang disebutkan di atas dan mencatat bahwa jalur terkait metabolisme lipid paling tinggi diperkaya. Pewarnaan BODIPY dan Oil Red O selanjutnya pada xenograft CCA tikus menunjukkan bahwa penekanan CXCL6 secara nyata mengurangi akumulasi lipid intratumoral, menunjukkan pemodelan ulang metabolisme lipid yang didorong CXCL6.
Penerapan lipidomik LC-MS untuk menganalisis sel HuCCT1 sh-NC dan sh-CXCL6 memungkinkan kami mengidentifikasi 342 metabolit diferensial. Kami mencantumkan 30 metabolit teratas dengan perbedaan terbesar dan menemukan bahwa pada sel sh-CXCL6, metabolit yang paling diatur turun termasuk dalam kelas fosfatidilkolin; fosfatidilkolin dilaporkan mempromosikan proliferasi sel tumor dan mengganggu fungsi sel T CD8+. Analisis jalur KEGG dari metabolit ini menyoroti pengayaan pada jalur lipid terkait kanker, termasuk "metabolisme gliserofosfolipid," "metabolisme asam linoleat," dan "metabolisme asam arakidonat." Membangun jaringan mengungkapkan bahwa "DG 12:0/14:0," "DG (18:0/20:1/0:0)," dan "DG (18:0/0:0/18:0)" terkait dengan sebagian besar jalur. Yang penting, diasilgliserol (DG) dikenal sebagai pedang bermata dua yang memengaruhi progresi tumor dan juga dapat mengatur TIME dengan mengaktifkan sel T CD8+ dan meningkatkan sitotoksisitas sel pembunuh alami (NK). Singkatnya, CXCL6 dapat secara signifikan memengaruhi kandungan metabolit kunci pada CCA, yang pada gilirannya dapat mengatur progresi tumor dan TIME.
Ekspresi CXCL6 Berkorelasi dengan Resistensi Imunoterapi dan Infiltrasi TAN pada CCA
Hasil di atas menunjukkan bahwa CXCL6 memberikan regulasi langsung pada sel CCA dan oleh karena itu dapat memengaruhi sensitivitas pengobatan GEM, membuat kami bertanya apakah tingkat ekspresi CXCL6 terkait dengan respons imunoterapi CCA. Melalui pewarnaan IHC dari TMA "Conversion therapy cohort", kami menemukan bahwa pasien dengan CXCL6 rendah (potongan 50%) lebih banyak mendapat manfaat dari imunoterapi, mengalami OS dan EFS yang lebih lama. Setelah mengumpulkan darah perifer dasar dari 26 pasien CCA sebelum imunoterapi, kadar CXCL6 serum diukur dengan ELISA dan menunjukkan bahwa non-responden cenderung memiliki konsentrasi CXCL6 serum yang lebih tinggi. Kadar CXCL6 yang lebih tinggi juga dikaitkan dengan OS dan EFS yang lebih pendek setelah imunoterapi. Sebuah studi xenograft subkutan hewan berdasarkan sel CCA asal tikus (mIC-23) dilakukan untuk menguatkan temuan klinis, pada tikus C57BL/6J. Penekanan ekspresi CXCL6 menggunakan siRNA. Penekanan CXCL6 meningkatkan efikasi terapi anti-PD-1, secara signifikan mengurangi berat dan volume tumor.
Secara keseluruhan, hasil-hasil ini sangat menunjukkan bahwa CXCL6 dapat menyebabkan resistensi imunoterapi CCA, jadi kami selanjutnya mengeksplorasi mekanisme potensial. Secara khusus, CXCR1/2 diekspresikan pada TANs di mana mereka mengatur rekrutmen TIME dan pembentukan NETs. Mengingat bahwa CXCL6 adalah kemokin yang mengikat reseptor ini, kami mempelajari pengaruhnya pada TANs, menerapkan pewarnaan IHC untuk mendeteksi hubungan antara CXCL6 dan infiltrasi TANs (CD10+) pada dua TMA CCA. Baik pada kohort "Surgery" maupun "Conversion therapy", kadar protein CXCL6 secara positif terkait dengan kepadatan TANs (R = 0,422, P < 0,001; R = 0,420, P = 0,015). Kami juga menganalisis korelasi CXCL6 dengan infiltrasi sel imun lainnya (sel T, makrofag, dan Treg), tetapi tidak ada hubungan signifikan yang jelas dalam kasus apa pun.
CXCL6 Mendorong Pembentukan NETs dan Mengganggu Infiltrasi Sel T CD8+
Untuk mengeksplorasi efek CXCL6 pada neutrofil, neutrofil perifer diisolasi dari darah dan dikultur bersama dengan sel HuCCT1 sh-NC atau sh-CXCL6; TANs diidentifikasi menggunakan flow cytometry. Dengan RNA-Seq, kami kemudian mengidentifikasi 240 gen yang diekspresikan secara berbeda (dengan log2|FC| ≥ 1, q-value ≤ 0,05) antara TANs yang dikultur pada dua konsentrasi CXCL6 yang berbeda.
Penerapan analisis KEGG menunjukkan bahwa "jalur pensinyalan MAPK" dan "jalur pensinyalan Ras" menempati peringkat tertinggi di antara gen-gen yang diekspresikan secara diferensial, sementara analisis GO mengungkapkan "wilayah ekstraseluler" dan "ruang ekstraseluler" sebagai dua istilah "komponen seluler" dengan peringkat tertinggi. Aktivasi jalur RAS/MAPK pada neutrofil yang terpapar CXCL6 diverifikasi dengan western blot. Jalur ini dilaporkan sebagai regulator hulu kunci pembentukan NETs, dan CXCR1/2 tampaknya juga terlibat. Dengan demikian, hasil kami sangat menyarankan peran CXCL6 dalam pembentukan NETs yang berasal dari TANs. Pewarnaan mIHC pada tumor mIC-23 tikus mengungkapkan bahwa penekanan CXCL6 sangat mengurangi pembentukan NETs, mengkonfirmasi ini sebagai mekanisme relevan yang potensial. Mengingat bahwa pembentukan spesies oksigen reaktif (ROS) adalah titik awal kunci untuk pembentukan NET, kami mengukur kadar ROS pada TANs setelah dikultur bersama dengan sel HuCCT1 dan menemukan bahwa kadar ROS menurun pada kelompok sh-CXCL6. Secara keseluruhan, bukti di atas mengungkapkan bahwa CXCL6 dapat memediasi pembentukan NETs di TIME CCA.
Sebuah studi sebelumnya menggambarkan bagaimana NETs berkontribusi pada penghambatan infiltrasi sel T tumor, jadi kami juga menganalisis populasi sel T pada tumor C57BL/6J tikus dengan pewarnaan mIHC. Analisis data menunjukkan tidak ada perbedaan signifikan pada sel T CD4+ antara kelompok "si-NC+IgG", "si-CXCL6+IgG" dan "si-NC+Anti-PD-1", sementara "si-CXCL6+Anti-PD-1" menunjukkan peningkatan. Untuk sel T CD8+, penekanan CXCL6 dan pengobatan anti-PD-1 sedikit meningkatkan jumlah sel T CD8+, pengobatan kombinasi menunjukkan rekrutmen sel T CD8+ terkuat. Karena kelelahan sel T CD8+ dilaporkan menyebabkan resistensi imunoterapi pada CCA, kami menyimpulkan bahwa CXCL6 mungkin mendasari resistensi ini dengan mengurangi infiltrasi sel T CD8+ melalui pembentukan NETs.
Untuk lebih mengkonfirmasi interaksi antara NETs, pembentukan dan infiltrasi sel T CD8+, kami melakukan eksperimen penyelamatan. Cl-amidine dipilih untuk melemahkan pembentukan NETs seperti yang dilaporkan, yang merupakan inhibitor langsung PAD4, penginduksi kunci NETs. Cl-amidine membalikkan pertumbuhan tumor yang didorong CXCL6. Berdasarkan hasil flow cytometry, kami menemukan bahwa ekspresi berlebihan CXCL6 sangat meningkatkan pembentukan NETs, yang ditunjukkan oleh kadar ROS. Pada saat yang sama, jumlah infiltrasi sel T CD8+ berkurang secara signifikan. Lebih meyakinkan bahwa Cl-amidine dapat membalikkan efek CXCL6 pada NETs, serta mengembalikan infiltrasi sel T CD8+. Kami juga memeriksa kadar IFNγ dan GzmB pada sel T CD8+, hasil menunjukkan bahwa NETs dapat mengurangi efek pembunuhan sel T CD8+. Kesimpulan yang sama dapat diamati dari pewarnaan mIHC MPO, NE, dan CD8 berdasarkan sampel jaringan tumor yang sama. Secara keseluruhan, hasil di atas secara bersama-sama menunjukkan bahwa CXCL6 menginduksi pembentukan NETs pada CCA, yang menghalangi infiltrasi dan fungsi pembunuhan sel T CD8+ dan pada akhirnya menyebabkan resistensi imunoterapi.
Diskusi
Studi yang terus berkembang menunjukkan keterlibatan keluarga sitokin CXCL dalam progresi berbagai keganasan. Sebagai faktor yang disekresikan, CXCL dapat menargetkan berbagai jenis sel untuk memberikan fungsi yang berbeda, dan peran mereka telah dipelajari secara khusus pada HCC. Misalnya, Wu et al. melaporkan bahwa ekspresi berlebihan CXCL6 pada sel HCC mengaktifkan jalur JAK-STAT3 pada hepatosit melalui pensinyalan parakrin. Di antara kanker hati, insidensi CCA menempati urutan kedua setelah HCC, namun mekanisme molekuler CXCL pada CCA hampir tidak dieksplorasi.
Penelitian kami mengidentifikasi CXCL6 sebagai onkoprotein multifungsi pada CCA. Pertama, kami menemukan CXCL6 sebagai faktor pro-angiogenik, mengamati bahwa ia dapat meningkatkan kadar VEGF pada CCA dan meningkatkan ekspresi HIF-1α. Selain menginduksi lingkungan hipoksia, HIF-1α bertindak sebagai regulator hulu faktor pertumbuhan vaskular. Kedua, kami menemukan bahwa ekspresi CXCL6 yang tinggi pada sel CCA mempercepat progresi dan metastasis tumor melalui mekanisme autokrin. Kami juga menguji apakah penekanan CXCL6 dapat mensensitisasi sel terhadap GEM, mengingat ini masih merupakan terapi lini pertama untuk CCA. Eksperimen in vivo dan in vitro menunjukkan bahwa GEM memiliki efek sitotoksik yang lebih kuat pada sel CCA yang kekurangan CXCL6.
Analisis pengayaan gen menunjukkan bahwa keseimbangan metabolisme pada CCA mungkin diubah oleh CXCL6, terutama metabolisme lipid. Metabolisme lipid adalah salah satu perubahan metabolisme paling menonjol pada kanker dan dapat menghasilkan energi, komponen biofilm, dan molekul pensinyalan yang diperlukan untuk proliferasi, invasi, dan metastasis sel tumor sambil memengaruhi mikro lingkungan tumor dan respons terhadap pengobatan kanker. Analisis lipidomik memungkinkan kami untuk memprofilkan perubahan metabolisme lipid terkait CXCL6 pada CCA dan menemukan beberapa metabolit inti, khususnya DG 'DG 12:0/14:0', 'DG (18:0/20:1/0:0)', dan 'DG (18:0/0:0/18:0)', yang ditemukan di pusat jaringan metabolisme.
Kelas metabolit DG memiliki fungsi yang relatif positif pada sel imun di TIME. Pada sel T, aktivasi reseptor sel T (TCR) memicu produksi DG dan merangsang transkripsi gen-gen yang terkait dengan ekspansi dan sitotoksisitas sel T. Namun, pengayaan DG dianggap sebagai ciri khas sel T CD8+ yang menginfiltrasi yang hiporesponsif, sementara ablasi genetik diasilgliserol kinase (DGK) meningkatkan aktivitas sitotoksisitas sel NK. Meskipun inhibitor bertarget untuk DGKα dan DGKζ telah dikembangkan dan diselidiki secara praklinis untuk imunoterapi tumor, fungsi tepat DG pada sel tumor masih kontroversial. Jalur hilir dan metabolit DG sangat kompleks sehingga lebih banyak penelitian diperlukan untuk mendapatkan pemahaman yang tepat. Dalam penelitian ini, kami tidak dapat mengklarifikasi fungsi rinci dari tiga metabolit inti DG tetapi mungkin menganalisis ini dalam studi selanjutnya.
Reseptor CXCL6, CXCR1 dan CXCR2, diekspresikan pada sel tumor dan imun, dan keduanya penting dalam fungsi CXCL6. Kami mengungkapkan bahwa JAK dapat diaktifkan oleh CXCR1/2 dan selanjutnya memfosforilasi protein STAT3 dan PI3K. Sepengetahuan kami, ini adalah studi pertama yang secara langsung menunjukkan hubungan antara CXCR1/2 dan JAK, yang dapat membantu mengklarifikasi efek CXCL6 pada sel CCA. Selain itu, CXCR1/2 adalah regulator penting infiltrasi TANs. Xiong et al. mendeteksi NETs yang diinduksi CXCL1/2 pada karsinoma sel skuamosa esofagus dan menemukan bahwa ini meningkatkan sel NK. Selanjutnya, NETs yang diinduksi oleh IL-8 melalui CXCR1/2 dapat mempromosikan progresi kanker lambung. Hasil RNA-Seq kami dengan neutrofil yang dikultur bersama sangat menyarankan bahwa pembentukan NETs dipengaruhi oleh CXCL6, dengan jalur RAS/MAPK terkait NETs berpartisipasi dalam proses ini seperti yang dilaporkan. Dengan demikian, kami berhipotesis bahwa CXCL6 mungkin mengatur efisiensi imunoterapi CCA dan menemukan, menggunakan sampel darah perifer dasar, bahwa kadar CXCL6 awal yang lebih tinggi menyebabkan prognosis yang lebih buruk. Dengan demikian, CXCL6 dapat berfungsi sebagai biomarker untuk imunoterapi. Kami juga melakukan eksperimen hewan di mana penekanan CXCL6 pada tumor C57BL/6J secara signifikan meningkatkan efikasi terapeutik mAb anti-PD-1. Perubahan pada TIME juga terdeteksi setelah penekanan CXCL6. Uji imunofluoresensi mengkonfirmasi bahwa penipisan CXCL6 mengurangi pembentukan NETs dan meningkatkan infiltrasi sel T CD8+. Sebuah eksperimen penyelamatan selanjutnya dilakukan untuk mengklarifikasi asumsi ini. Karena Cl-amidine menghambat kadar NETs yang disebabkan oleh ekspresi berlebihan CXCL6, infiltrasi dan efek pembunuhan sel T CD8+ juga meningkat, yang dapat membantu membangun hubungan sebab-akibat antara ekspresi CXCL6, pembentukan NETs, dan infiltrasi sel T CD8+. Kesimpulan ini juga mencerminkan laporan lain pada kanker pankreas, payudara, dan kandung kemih, di mana NETs telah terbukti menekan rekrutmen sel T CD8+ ke TIME. Sementara itu, kelelahan sel T CD8+ dilaporkan memediasi imunoterapi pada CCA, serta kanker lain termasuk melanoma, kanker kolorektal, dan kanker kandung kembal. Oleh karena itu, kami mengusulkan bahwa ekspresi CXCL6 yang tinggi pada CCA mengurangi infiltrasi sel T CD8+ melalui pembentukan NETs, yang pada akhirnya menyebabkan resistensi imunoterapi.
Kesimpulan
Melalui pendekatan multimodal, penelitian ini mengidentifikasi CXCL6 sebagai pendorong ganda progresi karsinoma kolangioselular (CCA) dan penghindaran imun. Secara mekanistik, CXCL6 mengaktifkan aksis CXCR1/2-JAK-STAT/PI3K pada sel CCA melalui pensinyalan autokrin dan memprogram ulang keseimbangan metabolisme lipid. Secara bersamaan, CXCL6 menginduksi pembentukan perangkap ekstraseluler neutrofil (NETs) melalui pensinyalan RAS/MAPK, yang menghambat infiltrasi sel T CD8+ dan menyebabkan resistensi imunoterapi. Menargetkan CXCL6 atau efektor hilirnya dapat menawarkan strategi sensitisasi baru untuk meningkatkan respons kemoterapi dan imunoterapi pada pasien CCA.
Referensi:
Artikel Lainnya
No comments:
Post a Comment