Amonia adalah metabolit sentral yang dihasilkan dari katabolisme asam amino, dan ketidakteraturannya dikaitkan dengan progresi kanker. Namun, mekanisme regulasi metabolisme amonia pada sel kanker masih kurang dipahami. Di sini, kami menunjukkan bahwa faktor transkripsi FOXO1 secara langsung mengaktifkan transkripsi argininosuccinate lyase (ASL), sebuah enzim kunci dalam siklus urea. Peningkatan sinyal FOXO1-ASL meningkatkan produksi urea dan menurunkan akumulasi amonia intraseluler. Secara fungsional, aktivasi jalur ini menekan migrasi dan metastasis sel kanker payudara baik in vitro maupun in vivo. Secara klinis, ekspresi tinggi FOXO1 dan ASL berkorelasi dengan peningkatan kelangsungan hidup pasien kanker payudara. Temuan ini mengungkapkan bahwa transkripsi ASL yang dimediasi FOXO1 memainkan peran penting dalam menjaga homeostasis amonia dan membatasi metastasis sel kanker, serta menunjukkan bahwa penargetan jalur ini dapat memberikan manfaat terapeutik.
Pendahuluan
Amonia adalah produk samping dari katabolisme asam amino dan metabolisme nitrogen. Dalam kondisi fisiologis, amonia didetoksifikasi terutama melalui siklus urea di hati, di mana ia dikonversi menjadi urea dan diekskresikan. Metabolisme amonia yang tidak teratur telah dikaitkan dengan beberapa kondisi patologis, termasuk ensefalopati hepatik dan kanker. Pada sel kanker, amonia tidak hanya berperan sebagai limbah metabolik, tetapi juga berfungsi sebagai molekul pensinyalan dan sumber nitrogen untuk mendukung proliferasi. Oleh karena itu, menjaga homeostasis amonia sangat penting bagi fisiologi sel kanker. Namun, regulasi transkripsional dari enzim-enzim yang terlibat dalam metabolisme amonia pada kanker sebagian besar masih belum diketahui.
Forkhead box O1 (FOXO1) adalah faktor transkripsi yang memainkan berbagai peran dalam metabolisme, kontrol siklus sel, dan respons terhadap stres. FOXO1 telah dilaporkan bertindak sebagai penekan tumor pada berbagai jenis kanker, tetapi perannya dalam mengatur metabolisme nitrogen belum sepenuhnya dieksplorasi. Argininosuccinate lyase (ASL) adalah enzim siklus urea yang mengkatalisis pemecahan argininosuksinat menjadi arginin dan fumarat, sehingga menghubungkan pembuangan nitrogen dengan metabolisme energi. Apakah FOXO1 secara transkripsional mengatur ASL dan apakah jalur ini berkontribusi pada progresi kanker belum pernah ditentukan.
Di sini, kami melaporkan bahwa FOXO1 secara langsung berikatan dengan wilayah promoter ASL dan mengaktifkan transkripsinya. Regulasi ke atas sinyal FOXO1-ASL meningkatkan produksi urea dan menurunkan kadar amonia intraseluler, sehingga menekan migrasi dan metastasis sel kanker payudara. Temuan ini mengungkapkan peran FOXO1 yang sebelumnya tidak dikenali dalam menjaga homeostasis amonia melalui regulasi ASL serta menyoroti potensi terapeutik dari penargetan jalur ini pada kanker payudara.
Metode Penelitian
Budidaya sel dan reagen
Garis sel kanker payudara MDA-MB-231, MCF-7, dan BT-549 diperoleh dari ATCC dan dipelihara dalam DMEM yang ditambahkan dengan 10% serum janin sapi dan 1% penisilin-streptomisin. Ekspresi berlebih dan penekanan FOXO1 dicapai menggunakan transduksi lentivirus. Ekspresi argininosuccinate lyase (ASL) dimodulasi menggunakan siRNA dan plasmid cDNA. Antibodi terhadap FOXO1, ASL, dan β-actin dibeli dari Cell Signaling Technology.
PCR real-time kuantitatif (qRT-PCR)
RNA total diekstraksi menggunakan reagen TRIzol, dan cDNA disintesis menggunakan reverse transcriptase. qRT-PCR dilakukan dengan SYBR Green Master Mix pada sistem ABI 7500 Real-Time PCR. GAPDH digunakan sebagai kontrol internal.
Western blotting
Sel dilisis dalam buffer RIPA dengan inhibitor protease. Protein dipisahkan dengan SDS-PAGE, ditransfer ke membran PVDF, lalu diinkubasi dengan antibodi primer dan antibodi sekunder berkonjugasi HRP. Deteksi dilakukan menggunakan reagen ECL.
Uji immunopresipitasi kromatin (ChIP)
Uji ChIP dilakukan untuk memeriksa ikatan FOXO1 pada promoter ASL. Sel difiksasi silang, dilisis, dan kromatin dipecah dengan sonikasi. Immunopresipitasi dilakukan menggunakan antibodi anti-FOXO1, dan fragmen DNA yang dimurnikan dianalisis dengan PCR.
Pengukuran urea dan amonia
Kadar urea pada supernatan kultur sel ditentukan menggunakan kit uji kolorimetrik. Konsentrasi amonia intraseluler diukur menggunakan kit uji amonia sesuai protokol produsen.
Uji migrasi dan invasi
Uji migrasi Transwell dan invasi Matrigel dilakukan. Sel ditempatkan dalam medium bebas serum pada ruang atas, dengan medium yang mengandung 10% FBS pada ruang bawah. Setelah inkubasi, sel yang bermigrasi atau menginvasi diwarnai dan dihitung.
Percobaan hewan
Semua studi hewan disetujui oleh Komite Etik Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusi. Tikus betina BALB/c nude disuntik dengan sel MDA-MB-231 melalui vena ekor untuk membangun model metastasis paru. Tikus dipantau, dan nodul metastatik dihitung dengan analisis histologis.
Analisis statistik
Data disajikan sebagai rata-rata ± SD. Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji-t Student atau ANOVA satu arah. Nilai p < 0,05 dianggap signifikan.
Hasil
FOXO1 mengatur ekspresi ASL pada sel kanker payudara
Untuk mengeksplorasi peran FOXO1 dalam metabolisme nitrogen, pertama-tama kami memeriksa ekspresi ASL setelah manipulasi FOXO1. Ekspresi berlebih FOXO1 secara signifikan meningkatkan kadar mRNA dan protein ASL pada sel MDA-MB-231 dan MCF-7, sementara penekanan FOXO1 menurunkan ekspresi ASL. Uji immunopresipitasi kromatin (ChIP) mengonfirmasi ikatan FOXO1 pada promoter ASL, menunjukkan adanya regulasi transkripsional langsung.
Sumbu FOXO1-ASL memodulasi metabolisme urea dan amonia
Selanjutnya, kami menguji apakah sinyal FOXO1-ASL memengaruhi metabolisme nitrogen. Ekspresi berlebih FOXO1 meningkatkan sekresi urea dan menurunkan kadar amonia intraseluler, sedangkan penekanan FOXO1 memberikan efek sebaliknya. Pentingnya, penghambatan ASL menghilangkan regulasi FOXO1 terhadap urea dan amonia, mendukung bahwa ASL adalah efektor hilir utama.
Sinyal FOXO1-ASL menekan migrasi dan invasi sel kanker payudara
Kami kemudian mengevaluasi konsekuensi fungsional dari regulasi FOXO1-ASL. Ekspresi berlebih FOXO1 secara signifikan menghambat migrasi dan invasi sel MDA-MB-231 dan BT-549, sementara penekanan FOXO1 meningkatkan proses tersebut. Penghambatan ASL membalikkan efek penghambatan FOXO1 pada motilitas sel, menunjukkan bahwa FOXO1 menekan metastasis melalui ASL.
Sumbu FOXO1-ASL menghambat metastasis kanker payudara in vivo
Untuk memvalidasi temuan ini in vivo, kami membangun model metastasis paru pada tikus nude. Tikus yang disuntik dengan sel yang mengekspresikan FOXO1 secara berlebih menunjukkan jumlah nodul metastasis paru yang jauh lebih sedikit dibandingkan dengan tikus kontrol. Sebaliknya, penekanan FOXO1 meningkatkan metastasis. Analisis histologis mengonfirmasi berkurangnya beban metastasis dengan aktivasi FOXO1-ASL.
Relevansi klinis ekspresi FOXO1 dan ASL pada kanker payudara
Akhirnya, kami menganalisis dataset publik pasien kanker payudara. Ekspresi tinggi baik FOXO1 maupun ASL secara signifikan berhubungan dengan kelangsungan hidup keseluruhan yang lebih lama dan risiko metastasis jauh yang lebih rendah. Hasil ini mendukung pentingnya sumbu FOXO1-ASL dalam progresi kanker payudara.
Diskusi
Metabolisme amonia merupakan aspek penting dari homeostasis nitrogen, namun ketidakteraturannya berkontribusi terhadap progresi kanker. Dalam penelitian ini, kami mengidentifikasi FOXO1 sebagai pengatur transkripsional dari argininosuccinate lyase (ASL), mengungkap mekanisme yang menghubungkan metabolisme nitrogen dengan penekanan metastasis kanker payudara.
Hasil kami menunjukkan bahwa FOXO1 secara langsung berikatan dengan promoter ASL dan meningkatkan transkripsinya, yang menyebabkan peningkatan produksi urea serta penurunan kadar amonia intraseluler. Dengan membatasi akumulasi amonia, sinyal FOXO1-ASL mengurangi migrasi dan invasi sel kanker payudara, serta menurunkan beban metastasis in vivo. Temuan ini menyoroti peran penekan tumor dari FOXO1 yang melampaui fungsi yang telah diketahui sebelumnya dalam regulasi siklus sel dan apoptosis.
Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa sel kanker mendaur ulang amonia sebagai sumber nitrogen untuk mendukung sintesis nukleotida dan asam amino, sehingga mendorong proliferasi. Data kami menyarankan bahwa aktivitas FOXO1-ASL melawan adaptasi metabolik ini dengan mempercepat pembersihan amonia melalui siklus urea. Hal ini dapat mengurangi ketersediaan nitrogen untuk jalur anabolik, sehingga menahan progresi kanker.
Secara klinis, ekspresi tinggi FOXO1 dan ASL dikaitkan dengan peningkatan hasil kelangsungan hidup pada pasien kanker payudara, menegaskan relevansi translasional dari jalur ini. Penting untuk dicatat bahwa aktivitas FOXO1 sering ditekan dalam kanker melalui sinyal PI3K/AKT, sehingga muncul kemungkinan bahwa strategi terapeutik yang bertujuan memulihkan fungsi FOXO1 atau meningkatkan ekspresi ASL dapat bermanfaat.
Sebagai kesimpulan, penelitian ini menetapkan transkripsi ASL yang dimediasi FOXO1 sebagai mekanisme pengatur utama untuk homeostasis amonia dan penekanan metastasis pada kanker payudara. Penargetan sumbu FOXO1-ASL dapat memberikan peluang baru untuk intervensi terapeutik pada pasien dengan penyakit agresif.
Kesimpulan
Secara ringkas, penelitian kami mengidentifikasi FOXO1 sebagai pengaktif transkripsional dari argininosuccinate lyase (ASL) pada kanker payudara. Dengan meningkatkan ekspresi ASL, FOXO1 mendorong produksi urea, mengurangi akumulasi amonia intraseluler, serta menekan migrasi dan metastasis sel kanker payudara. Secara klinis, ko-ekspresi FOXO1 dan ASL berkorelasi dengan hasil kelangsungan hidup yang lebih baik, menyoroti potensi sumbu ini sebagai target terapeutik. Temuan ini menetapkan hubungan penting antara metabolisme nitrogen dan progresi kanker serta menyarankan peluang baru untuk intervensi pada kanker payudara yang agresif.
Artikel Lainnya
No comments:
Post a Comment